抗氧化活性的测定是确定其自由基清除能力的评定方法之一。其特征在于化合物（或化合物混合物）抑制各种生物分子氧化反应的能力。近年来，黑果腺肋花楸因其特殊的抗氧化能力而备受关注。不老莓抗氧化剂主要由维生素C和多酚组成，如花青素、酚酸、黄烷醇、黄酮醇和单宁。
不老莓提取物的抗氧化效果可以通过不同的体外试验来评估。超氧自由基清除能力测定实验研究表明，来自黑色不老莓的丙酮提取物比其他品种提取物更强，是蓝莓（Vaccinium corymbosum）提取物的5倍，蔓越橘（Vaccinium macrocarpon）提取物的8倍和越橘（Vaccinium vitisidaea）提取物的4倍以上。研究进一步扩展到其他浆果，如黑醋栗（Ribes nigrum）、红醋栗（Ribes rubrum）、醋栗（Ribes grossularia）和接骨木莓（Sambucus nigra），研究证明不老莓是所提及物种中最有效的抗氧化剂。目前市场流行不同果汁的抗氧化能力比较[8]如表3—1所示。① TEAC，总抗氧化能力，数据以每毫升抗氧化剂当量的微摩尔数表示。通过研究对2，2—二苯基—1—苦基肼（DPPH）自由基和2，2′—联氮双（3—乙基苯并噻唑啉—6—磺酸）（ABTS）自由基的清除作用，发现不同品种的不老莓提取物均在体外显示出显著的抗氧化活性。研究表明，来自不老莓浆果的多酚化合物对齐拉西酮在体外诱导的血浆脂质过氧化有明显的降低作用。研究还发现不老莓果汁在过氧化脂质体系统中起到对磷脂酰胆碱氧化的抑制作用，其效率大约是红醋栗果汁的2倍。此外，在上述实验中，不老莓果汁显然与α—生育酚发挥了协同作用，但该反应未在红醋栗果汁中观察到。血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆解脱落下来的小块胞质。血小板的主要功能是凝血和止血，修补破损的血管。当血管破损时，血小板受到损伤部位激活因素刺激出现聚集，成为血小板凝块，起到初级止血作用，接着血小板又经过复杂的变化产生凝血酶，使邻近血浆中的纤维蛋白原变为纤维蛋白，互相交织的纤维蛋白使血小板凝块与血细胞缠结成血凝块，即血栓。血小板不仅具有促进血栓形成的作用，而且是炎症和动脉粥样硬化的重要因素。被激活后的血小板通过表达和释放炎症介质，诱导白细胞的炎症作用，促进内皮细胞活化及变形，形成动脉粥样硬化和血管血栓病变。不老莓提取物在体外对人血小板功能有显著影响。Olas等人[9]研究表明，浓度为5～50 μg/mL的不老莓提取物（总多酚为309.6 mg/g）显示出由过氧亚硝酸盐诱导的对人血小板蛋白质和脂质的氧化／硝化损伤的保护作用，并且显著抑制了血小板蛋白质羰基化和硫醇氧化。不老莓提取物明显降低了由过氧亚硝酸盐引起的血小板脂质过氧化。当血小板暴露于浓度为0.1 mmol/L的过氧亚硝酸盐中时，血小板蛋白质中游离巯基明显减少。来自不老莓的提取物保护了血小板蛋白硫醇免受过氧亚硝基阴离子（ONOO－）诱导的氧化作用，抑制了过氧亚硝酸盐的毒性。在另一组实验中，研究者观察到乳腺癌患者血小板蛋白质中氧化／硝化应激的生物标志物水平增加，如3—硝基酪氨酸。这项研究提供了不老莓提取物抗氧化特性及其清除过氧亚硝酸根的能力的证据，过氧亚硝酸根在血管系统中形成，其可能引起氧化／硝化压力，并损害血小板中的一些生物分子，如蛋白质和脂质。据显示，不老莓提取物的抗血小板效果高于白藜芦醇，这表明该提取物作为人类饮食的一个组成部分，在预防涉及血小板的心血管或炎症疾病中可能发挥重要作用。实验表明，腺肋花楸提取物（5～50 μg/mL）能减少血小板黏附、聚集和血小板中负氧离子（
）的产生。Malinowska等人[10]利用高同型半胱氨酸血症模型研究了不老莓提取物对血块形成和溶解的影响。研究发现不老莓提取物减少了同型半胱氨酸对纤维蛋白原或血浆止血性能的不良影响，这表明其在由高同型半胱氨酸血症诱导的CVD中可能具有保护性。此外，在高同型半胱氨酸血症模型中，不老莓提取物增强了血浆抗氧化活性，这能帮助人类调节血浆的止血性能。另一组体外实验显示，不老莓提取物延长了凝血时间，降低了人类血浆中纤维蛋白聚合速度。此外，研究发现将凝血酶与提取物一起孵育抑制了该酶活性。Sikora等人[11]观察到，男性服用不老莓提取物1个月后，血小板聚集受到显著抑制。补充不老莓提取物不会影响受检患者血液中血小板的总数，但会延长达到峰值所需的时间。在内源性凝血酶诱导的凝血情况下，在补充不老莓提取物1或2个月后，凝血潜力显著降低。很明显，不老莓提取物的抗凝血活性不仅仅是由于其清除自由基的作用，而且还包括对某些酶的抑制作用。活性氧物质（reactive oxygen species, ROS）参与各种生理和病理反应，如炎症信号传递、老化，神经变性病和癌症发生。机体内ROS的重要来源之一是活化的中性粒细胞和巨噬细胞。微量的ROS在某些生理过程中可发挥调控作用，尤其在信号传导方面。过量的ROS可引起细胞氧化损伤。虽然中性粒细胞在宿主防御中是最重要的吞噬细胞，但产生的ROS及蛋白水解酶、特别是嗜天青蓝颗粒中的中性蛋白酶是引起周围组织和其他血细胞损伤的重要因素，成为多种慢性炎症的重要病因。Zielińska-Przyjemska等人[12]研究了不老莓果汁对肥胖和非肥胖个体中性粒细胞氧化代谢和凋亡的体外影响。不老莓果汁以及花青素能显著抑制肥胖和非肥胖患者活化的多形核中性粒细胞的氧化代谢，进而导致氧化应激显著减少。用黑果腺肋花楸花青素补充剂膳食30天后可使高胆固醇血症患者的血细胞氧化状态显著改善。血管炎症是动脉粥样硬化发病机制中的主要疾病，可引发急性冠状动脉综合征。炎症过程的早期阶段是内皮激活，这是白细胞募集的直接原因。这一过程通过内皮细胞表面表达的细胞黏附分子（CAM）介导，黏附分子包括细胞间黏附分子—1（ICAM—1）和血管细胞黏附分子—1（VCAM—1）。CAM表达的改变与多种慢性炎症相关，包括动脉粥样硬化（AS）。动脉粥样硬化是一种具有慢性炎症反应特征的病理过程。血管内皮细胞在引发和扩大动脉炎症反应中起了关键的作用。以核转录因子（NF—κB）家族为调控中心的内皮细胞活化及炎症基因诱导途径有可能成为有关危险因子促动脉粥样硬化形成的共同途径。选择性保护内皮细胞，调节内皮细胞的炎症反应，可能是合理的AS治疗靶点之一。Zapolska—Downar等人[13]在用肿瘤坏死因子α（TNF—α）（10 ng/mL）治疗前，用不同浓度（主要是50 μg/mL）的不老莓提取物预处理人类主动脉内皮细胞（HAEC）。研究发现，被测提取物通过抑制ICAM—1和VCAM—1的表达来抑制内皮细胞的促炎反应，该提取物减弱了NF—κB p65的磷酸化，并减少了TNF—α处理的HAEC的细胞内ROS的产生。此外，受试提取物对TNF—α诱导的VCAM—1表达的抑制作用与布洛芬和吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）相似，对TNF—α刺激的ICAM表达的抑制作用远大于观察两种抗炎药物得到的效果。用不老莓提取物预培养血细胞导致TNF—α刺激的外周血单个核白细胞黏附性增加，这可能是不老莓提取物发挥抗炎和抗动脉粥样硬化作用的重要机制。同时发现，TNF—α诱导了更高水平的NF—κB磷酸化，当用不老莓提取物预处理时，这种磷酸化水平可以在血细胞中减少，这表明这种提取物在体外的抗炎特性至少部分是通过抑制NF—κB活化来介导的。细胞氧化还原状态调控转录因子NF—κB在TNF—α诱导的ICAM—1和VCAM—1表达中起着关键作用。众所周知，ROS参与NF—κB的活化，并干扰信号通路，这导致磷酸化和磷酸化激酶ⅠκB的降解。基于这些结果，研究者认为，不老莓提取物对ICAM—1和VCAM—1表达以及NF—κB活化的抑制作用是其抗氧化特性导致的结果。在另一组实验中，研究者发现不老莓提取物内皮依赖性血管舒张效果均高于越橘和接骨木莓提取物。众所周知，ROS可通过直接损伤内皮和化学猝灭一氧化氮（NO），来损害内皮NO功能，所以可通过增强或保护内皮NO系统，或清除并灭活ROS的因子，达到预防心血管疾病目的。不老莓提取物之所以具有血管保护作用，是因为其具有高抗氧化活性，这将降低抵达动脉内皮的超氧化物或ROS的有效浓度。更为重要的是，这种防止内皮依赖性损失、NO介导舒张损失的能力可以在极低浓度（口服不老莓产品后，可在人血浆中获得该浓度）中实现。在癌症治疗（放射治疗或化疗）期间，患者体内容易产生大量ROS，诱导细胞损伤。例如，临床上用于抗癌治疗的广谱化疗药物——阿霉素，却有很大的毒副作用。它在药物代谢过程中容易诱导ROS的产生，降低谷胱甘肽水平，诱导血小板的细胞毒性。从乳腺癌患者分离出的血小板不仅可以产生
，还可以产生过氧亚硝酸盐，此外，化疗第Ⅰ阶段后的血小板
水平显著高于手术前或手术后水平，这表明化疗可使血小板中生成ROS。ROS造成的损害，与包括癌症在内的多种疾病的发病机制有关。活性氧增加会增加突变率，促进正常细胞向肿瘤细胞转化，活性氧也能促进驱动肿瘤发生和进展中重要信号分子的稳定，也就是说，活性氧不仅是肿瘤产生的因素，也是肿瘤恶化的因素。大量证据表明，在癌症期间，人体的内源性抗氧化保护系统已经不起作用。据报道，一些恶性肿瘤中谷胱甘肽的含量发生了变化，这可能会促进浸润性乳腺癌患者和良性乳腺疾病患者的氧化应激。不老莓提取物和其他产品可以降低乳腺癌患者手术前后以及肿瘤治疗各个阶段的氧化应激。由于抗氧化作用，不老莓提取物显著降低了乳腺浸润性癌患者术后血小板氧化／硝化应激，癌症患者红血细胞中还原型谷胱甘肽的含量也有所降低。Olas等人[14]研究表明浸润性乳腺癌患者和良性乳腺疾病患者血浆中总谷胱甘肽、半胱氨酸和半胱酰甘氨酸的水平比健康志愿者对照水平低50%。此外，对比健康组，患者血浆中硫醇化合物的还原形式（GSH、CSH和CGSH）和氧化形式（GSSG、CSSC和CGSSGC）的水平也发生变化。相反，浸润性乳腺癌患者血浆中的同型半胱氨酸水平比对照组血浆中的同型半胱氨酸水平高15%。当存在不老莓提取物（50 μg/mL）时，浸润性乳腺癌患者和良性乳腺疾病患者血浆中巯基含量的变化在体外显著减弱，对比相同浓度的纯白藜芦醇，不老莓提取物的抗癌作用更有效。通过增强血浆SOD或其他酶，不老莓多酚可以诱导抗氧化能力的提高。Malik等人[15]揭示，将人体HT—29结肠癌细胞暴露于不老莓花青素提取物的50 μg/mL中24小时，可产生60%的生长抑制效果。不老莓提取物以浓度依赖性方式抑制HT—29细胞中环氧合酶—2（COX—2）基因表达。正常结肠细胞NCM 460中并未显示COX—1或COX—2基因的表达出现显著变化。环氧合酶催化花生四烯酸的氧化，促使形成前列腺素。大量流行病学研究表明，COX基因的抑制与结肠癌的预防有关，并且在结肠直肠腺瘤和癌中观察到COX—2表达的上调。抑制COX—2酶的药物，特别是非甾体抗炎药，可以延缓或预防结肠癌。Zhao等人[16]研究了富含不老莓花青素的提取物对结肠癌的潜在化学预防活性。实验测定了暴露于提取物（10～75 μg/mL）的结肠癌衍生HT—29和无致癌性结肠NCM 460细胞的生长情况。研究发现，暴露于25 μg/mL提取物48小时后，HT—29细胞生长受到50%的抑制。最为重要的是，较低浓度的提取物不会抑制NCM 460细胞的生长，这说明相比无致癌性结肠细胞，对结肠癌细胞的生长抑制更强。Gasiorowski等人[17]在艾姆斯（Ames）试验中证实，从不老莓果实中分离出的花青素提取物可以抑制苯并芘和2—氨基芴的诱变活性，且在体外培养的人体血源性淋巴细胞中观察到苯并（a）芘（Benzo(a)pyrene）诱导的姐妹染色单体交换频率显著降低。研究结果表明，花青素的抗突变作用主要是通过自由基清除作用实现的。Bermúdez-Soto等人[18]证明，反复暴露于不老莓果汁对人体结肠直肠癌细胞系Caco—2具有有效的体外增殖抑制效果，这种增殖抑制效果与G2/M细胞周期阻滞有关。通过对基因表达的分析，他们检测到了几种结肠癌典型肿瘤标记物mRNA水平的变化，以及与治疗相关的参与增殖和细胞周期的蛋白质mRNA水平的变化。Lala等人[19]用富含花青素的不老莓提取物喂食用结肠致癌物氮氧基甲烷诱导的雄性大鼠14周，检测结肠异常隐窝病灶的数量和多样性、结肠细胞增殖、DNA氧化损伤水平以及环氧化酶基因的表达等结肠癌生物标志物。与对照组相比，这些特定的生物标志物在接受处理的大鼠体内含量较低，说明该提取物在结肠癌发生过程中具有保护作用，并表明多种作用机制。如前所述，大肠杆菌的一些菌株可以水解不老莓中丰富的绿原酸，释放咖啡酸，而咖啡酸是一种更强效的抗氧化剂。Sharif等人[20]观察了富含多酚的不老莓果汁（内含7.15 g/L多酚）对急性淋巴细胞白血病Julkat细胞系的抗癌效果。实验结果表明，该果汁抑制了癌细胞增殖，同时引起细胞凋亡。在另一项研究中发现，不老莓提取物对白血病细胞表现出大于90%的抑制活性。尽管大部分不老莓多酚类物质在消化过程中会转化，但它们仍然可以作为强力抗氧化剂和抗增殖剂。研究发现，被消化的研究果汁使Caco—2细胞增殖率降低约25%。胰岛β细胞是氧化应激的重要靶点。β细胞内抗氧化酶水平较低，故对ROS较为敏感。当β细胞暴露于过量游离脂肪酸和慢性高血糖可诱发氧化应激。ROS可直接损伤胰岛β细胞，促进β细胞凋亡，还可通过影响胰岛素信号转导通路间接抑制β细胞功能。β细胞受损，胰岛素分泌水平降低、分泌高峰延迟，血糖波动加剧，因而难以控制餐后血糖的迅速上升，对细胞造成更为显著的损害。Ruginǎ等人[21]评估了纳摩尔浓度条件下不老莓提取物对高剂量葡萄糖诱导的胰岛β细胞氧化应激的保护作用。结果表明，相比未经处理的细胞，不老莓花青素对细胞内ROS物质具有清除作用，花青素对谷胱甘肽（由高血糖诱导）的减少与剂量有关，随剂量增加，其抑制作用增强。由于高血糖导致糖尿病相关肝脏并发症发生病理改变，氧化应激有所增强。谷胱甘肽（GSH）抗氧化系统对于抵抗氧化应激诱导的细胞内损伤至关重要。在最近的一项研究中，Zhu等人[22]观察到，使用花青素—3—葡萄糖苷处理人体肝癌HepG2细胞时，显著降低了高血糖诱导的ROS水平。花青素—3—葡萄糖苷培养增加了谷氨酸—半胱氨酸连接酶的表达，这种表达独立于Nrf1/2转录因子，并介导ROS水平的降低。花青素通过蛋白激酶A（PKA）激活，增加cAMP应答元件结合蛋白（CREB）的磷酸化。花青素3—葡萄糖苷降低ROS水平，导致磷酸丝裂原活化蛋白激酶—4（MK44）—Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路受到显著抑制，从而导致促凋亡Fas减少。因此，花青素显著降低了HepG2细胞的凋亡，提高了其生存能力。
声明：版权归原作者所有，部分图片来源于网络公开渠道，不能识别来源，在此引用仅作为科普宣传素材，非商业用途，如有侵权，请联系更正。
